PKKK/300/UP/015 Id EDD dalam produk tradisional

Peralatan

HPLC AGILENT 1100/RRLC AGILENT 1200 SERIES

Column: ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl 5µ, 150 x 4.6 mm

Reference standard: Sildenafil Citrate, Vardenafil & Tadalafil

Trifluoroacetic Acid (HPLC Grade)

Acetonitrile (HPLC Grade)

Ammonia 25%

Deionized water

Beakers

Separators

Evaporating dish

Measuring cylinder

Ultrasonic bath

Syringe filter 0.45µm

Syringe

Aluminium foil

Membrane filter 0.45µm

Penyediaan Sampel

Sampel yang perlu diuji menggunakan tatacara pengujian ini perlu diekstrak terlebih dahulu menggunakan teknik Liquid-liquid extraction (LLE). Sila rujuk dokumen PKKK/300/UP/014 (Pengekstrakan Fasa Cecair Bagi Produk Tradisional, Suplemen Kesihatan dan Kosmetik)

Proses persampelan adalah berbeza mengikut bentuk dosej. Sila rujuk dokumen PKKK/300/UP/001 (Proses Persampelan).

Ubah pH larutan sampel menggunakan ammonia kepada pH >11. Nilai pH yang diinginkan boleh diperiksa dengan menggunakan kertas pH.

Ekstrak larutan sampel sebanyak 2 kali dengan 50 mL chloroform menggunakan separating funnel.

Ulang langkah iv dan v menggunakan baki larutan sampel di dalam separating funnel tadi.

Setelah kering, residu yang diperolehi dilarutkan dengan lebih kurang 3 mL Acetonitrile:Water (50:50).

6.4.3.1 Sediakan larutan stok piawai rujukan tunggal dengan mengikut prosedur yang dinyatakan dalam 6.4.1 hingga 6.4.2, tetapi dengan menggunakan satu piawai rujukan tunggal sahaja (single standard solution).

6.4.3.2 Prosedur ini hanya diguna pakai untuk menjalankan ujian identifikasi satu kompaun sahaja.

System Suitability Test perlu dijalankan untuk setiap analisis bagi memastikan keseluruhan sistem berfungsi dengan baik. Jalankan sekurang-kurangnya enam suntikan replikasi larutan piawai rujukan (0.05 mg/mL)

Kriteria:

%RSD for retention time: Not more than, NMT 2.0%

Tailing factor not more than (NMT) 2.0

Table 1: HPLC system used for identification of Sildenafil, Vardenafil & Tadalafil

Rujuk dokumen PKKK/300/UP/003 (RRLC 1200 series) dan PKKK/300/UP/011 (Shimadzu High Performance Liquid Chormatography) berkenaan prosedur penggunaan alat-alat ini.

Injek diluent, kemudian injek larutan piawai rujukan 0.05mg/mL sebanyak enam kali apabila HPLC telah sedia untuk analisis.

Kemudian injek larutan sampel secara duplicate juga. Perhatikan peak dan spectrum sampel yang diperolehi.

Injek diluent sebelum sampel seterusnya.

Internal Quality Control (IQC)

Injek 10 µL larutan piawai rujukan selepas setiap lima sampel dan sebelum menamatkan analisis.

Kriteria untuk Internal Quality Control Check (IQC):

Peratus perbezaan retention time bagi larutan piawai rujukan tidak boleh melebihi 3% bagi setiap kumpulan 5 sampel tersebut.

Rujuk dokumen PKKK/300/UP/003 (RRLC 1200 series) atau PKKK/300/UP/011 (Shimadzu HPLC). Perhatikan peak dan spectrum yang diperolehi untuk sampel dan bandingkan dengan peak dan spectrum RS.

Sesuatu sampel dianggap mempunyai indikasi kehadiran analit dan wajib diteruskan dengan pemilihan tatacara pengesahan di bawah perenggan 6.6.3 sekiranya memenuhi kriteria berikut:

i. Perbezaan Retention Time antara puncak sampel dengan piawai rujukan tidak melebihi ±3% ATAU

ii. Secara visual, spektrum UV sampel menunjukkan corak penyerapan yang identikal atau setara dengan profil piawai rujukan ATAU

iii. Nilai Similarity Factor puncak bagi sampel hendaklah mencapai sekurang-kurangnya 0.999. Sekiranya puncak menunjukkan tanda ketepuan melampau (saturated/flat-top), nilai Similarity Factor 0.999 mungkin tidak tercapai pada peringkat ini. Sampel tetap dikategorikan sebagai mempunyai indikasi kehadiran analit berdasarkan kriteria (i) atau (ii), dan hendaklah diteruskan terus ke 6.6.3.

Bagi sampel yang mempunyai indikasi kehadiran analit (perenggan 6.6.2), penganalisis hendaklah memilih salah satu daripada dua tatacara pengesahan berikut berdasarkan integriti puncak dan respons instrumen:

6.6.3.1 TATACARA A: Pengesahan secara Penambahan Piawai (Spiking)

Volume of diluent (mL) =

Kemudian campurkan 1mL sampel dengan diluent (volum diluent rujuk hasil pengiraan perenggan i). Sonicate selama 5 minit.

Injek larutan sampel diluted menggunakan tatacara pengujian yang sama.

Untuk mendapatkan kepekatan RS untuk spiking, guna formula pengiraan di bawah.

Concentration of RS (mg/ml) =

Spike 0.5mL larutan sampel diluted dengan 0.5mL RS (1:1) ke dalam vial.

Injek larutan spiked dan semak peak dan spectrum yang diperolehi.

6.6.3.2 TATACARA B: Pengesahan secara Pencairan Lanjutan

Tatacara ini dipilih sebagai alternatif pengesahan muktamad bagi sampel berkepekatan ekstrem, di mana respons puncak menunjukkan tanda ketepuan detektor (detector saturation), puncak terpotong (truncated peak), atau melampaui julat dinamik linear. Pencairan lanjutan perlu dilakukan untuk sampel dalam kategori ini.

i. Pencairan asas boleh dilakukan menggunakan dilution factor atau volume of diluent yang dikira menggunakan formula di 6.6.3.1 (i).

ii. Proses pencairan boleh dilakukan secara berperingkat mengikut kesesuaian.

iii. Bagi kes ketepuan ekstrem, anggaran gandaan pencairan yang lebih tinggi boleh digunakan sebagai sasaran awal bagi memastikan respons analit kembali ke julat linear detektor dengan efisien.

iv. Langkah 6.6.3.2 (i) perlu diulangi sekiranya respon puncak masih menunjukkan tanda ketepuan detektor.

v. Penggunaan Tatacara B adalah sah sebagai bukti identifikasi akhir apabila memenuhi kriteria berikut:

a. Respons puncak sampel adalah setara/setanding dengan respons piawai rujukan (SST).

b. Nilai similarity factor mestilah mencapai 0.999 pada kepekatan setara tersebut.

c. Visual overlay menunjukkan padanan profil penyerapan UV yang sempurna apabila ditindih dengan piawai rujukan.

vii. Semua rantaian kromatogram yang terhasil daripada siri pencairan ini (contoh: 1:53, 1:75, 1:100, 1:350) hendaklah dilampirkan sebagai rantaian bukti teknikal penentuan julat linear yang sahih.